mTOR信号通路在iPS定向分化RPE细胞中的调控机制研究

《中华细胞与干细胞杂志(电子版)》[ISSN:2095-1221/CN:11-9310/R] 期数: 2014年第4卷第1期 栏目: 论著

作者:蒋超,石厚霞,丁思加等

单位:

关键词:

页码:36-43

摘要:

 

【摘要】 目的  探讨mTOR信号通路在iPS定向分化RPE细胞中的调控机制。方法  培养iPS细胞,悬浮培养后形成拟胚体EB,诱导分化为RPE细胞。通过免疫细胞化学的方法,观察iPS-RPE细胞分化一个月后特异性蛋白(RPE65、LRAT、zo-1)的表达。同时通过Q-PCR,Western Blotting的方法检测iPS-RPE在不同分化时间点(分化1个月、2个月、3个月)上,iPS-RPE细胞中特异性基因、蛋白的表达变化以及mTOR信号通路的活性。最后应用雷帕霉素抑制iPS-RPE细胞中mTOR的通路,进一步观察iPS-RPE细胞中的蛋白表达变化。Q-PCR采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行组间比较。结果  荧光显微镜观察到iPS-RPE细胞在分化1个月时,表达RPE65、LRAT、zo-1蛋白。与对照组iPS比较,Q-PCR结果显示,实验组RPE65在分化1个月,2个月,3个月时的表达量分别为0.84 ± 0.13,4.8 ± 1.1,20.3 ± 4.9(P = 0.000);Best1分化1个月,2个月,3个月时的表达量分别为1.5 ± 0.16,2.3 ± 0.68,11.78 ± 1.57(P = 0.000);MerTK在分化1个月,2个月,3个月时的表达量分别为4.12 ± 1.94,1.87 ± 0.76,15.53 ± 1.33(P = 0.000),CK18分化1个月,2个月,3个月时的表达量分别为2.4 ± 0.63,2.3 ± 0.37,9.67 ± 1.44(P = 0.000),Western Blotting结果也表明,随着分化时间延长,iPS-RPE细胞中特异性蛋白(BEST1、catenin、MerTK)表达量有显著提高,而mTOR信号通路的活性受到抑制。与对照组(加DMSO)比较,雷帕霉素处理获得的iPS-RPE细胞中BEST1、MerTK 、ck18蛋白表达量上升不是很明显,catenin蛋白显著提高。结论  建立了体外高等分化、功能高效的iPS-RPE细胞,随iPS-RPE细胞分化时间延长,mTOR信号通路的活性是逐步抑制的。
【关键词】 潜能干细胞; 视网膜; 上皮细胞; 细胞分化; 信号通路
 
 
 下载信息  [文件大小:1.51 MB 下载次数: 次]
点击下载文件:mTOR信号通路在iPS定向分化RPE细胞中的调控机制研究

 

【摘要】 目的  探讨mTOR信号通路在iPS定向分化RPE细胞中的调控机制。方法  培养iPS细胞,悬浮培养后形成拟胚体EB,诱导分化为RPE细胞。通过免疫细胞化学的方法,观察iPS-RPE细胞分化一个月后特异性蛋白(RPE65、LRAT、zo-1)的表达。同时通过Q-PCR,Western Blotting的方法检测iPS-RPE在不同分化时间点(分化1个月、2个月、3个月)上,iPS-RPE细胞中特异性基因、蛋白的表达变化以及mTOR信号通路的活性。最后应用雷帕霉素抑制iPS-RPE细胞中mTOR的通路,进一步观察iPS-RPE细胞中的蛋白表达变化。Q-PCR采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行组间比较。结果  荧光显微镜观察到iPS-RPE细胞在分化1个月时,表达RPE65、LRAT、zo-1蛋白。与对照组iPS比较,Q-PCR结果显示,实验组RPE65在分化1个月,2个月,3个月时的表达量分别为0.84 ± 0.13,4.8 ± 1.1,20.3 ± 4.9(P = 0.000);Best1分化1个月,2个月,3个月时的表达量分别为1.5 ± 0.16,2.3 ± 0.68,11.78 ± 1.57(P = 0.000);MerTK在分化1个月,2个月,3个月时的表达量分别为4.12 ± 1.94,1.87 ± 0.76,15.53 ± 1.33(P = 0.000),CK18分化1个月,2个月,3个月时的表达量分别为2.4 ± 0.63,2.3 ± 0.37,9.67 ± 1.44(P = 0.000),Western Blotting结果也表明,随着分化时间延长,iPS-RPE细胞中特异性蛋白(BEST1、catenin、MerTK)表达量有显著提高,而mTOR信号通路的活性受到抑制。与对照组(加DMSO)比较,雷帕霉素处理获得的iPS-RPE细胞中BEST1、MerTK 、ck18蛋白表达量上升不是很明显,catenin蛋白显著提高。结论  建立了体外高等分化、功能高效的iPS-RPE细胞,随iPS-RPE细胞分化时间延长,mTOR信号通路的活性是逐步抑制的。
【关键词】 潜能干细胞; 视网膜; 上皮细胞; 细胞分化; 信号通路