诱导人胚胎干细胞分化形成具有三维结构的视网膜样组织的方法研究

《中华细胞与干细胞杂志(电子版)》[ISSN:2095-1221/CN:11-9310/R] 期数: 2016年第6卷第3期 栏目: 论著

作者:宋健 李宗义 徐国彤 等

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页码:146-154

摘要:

  【摘要】 目的 探讨在成分简单的培养条件下将人胚胎干细胞(hESCs)通过3D培养的方式诱导分化为人神经视网膜各种细胞的方法。方法 将不同系的hESCs用消化酶消化后,以团块形式悬浮培养在含有1﹪ Matrigel的培养液中。对于SHhES8系的hESCs在第1天加入BMP4信号通路抑制剂,然后每2天换液以逐渐降低其浓度。在分化的不同时间,通过检测全能性基因和视网膜标志基因的表达水平以确定hESCs团块的分化状态。对于H9系的hESCs,抑制Wnt信号通路以促进hESCs分化过程中神经视网膜前体细胞重要转录因子CHX10的表达。数据经GraphPad Prism 6.0c student's t-test分析处理。结果 (1)H9系hESC经过15 d的分化,各眼区转录因子的表达水平都有大幅上调(与D0相比,D4时SIX3水平上升到720.1±238.6,P = 0.039;SIX6上升到260.0±132.5,P = 0.122;PAX6上升到2661±1353,P = 0.121;LHX2上升到480.4±27.56,P < 0.000;RAX上升到144.9±35.61,P = 0.016),免疫荧光检测也显示此时分化的细胞已经具备早期视网膜细胞的特征;(2)在H9系hESCs分化第7天添加IWR1e抑制Wnt信号通路,可以有效地提高CHX10的表达,使含CHX10阳性细胞的团块的比例从0﹪上升到86.6﹪(P = 0.000),表明Wnt信号通路在视网膜细胞形成中起重要的调节作用;(3)SHhES8系的hESCs通过悬浮培养,在第24天时可以检测到有CHX10阳性的视泡样结构,继续培养至83 d,可以检测表达不同的神经视网膜细胞标志基因的细胞,包括CRX阳性的感光细胞或前体细胞、AP2α阳性的无长突细胞和ISLET1阳性的神经节细胞。结论 不同系的hESCs对同样的诱导分化显示出不同的反应;抑制Wnt信号通路可以促使CHX10表达,实现早期视网膜细胞的分化成熟;利用无血清悬浮培养的方式,可以使hESCs分化为各种视网膜细胞和具有一定三维结构的视网膜样组织。
  【关键词】 人类; 胚胎干细胞; 细胞分化; 视网膜