差速贴壁法体外分离培养小型猪脂肪间质干细胞的实验研究

《中华细胞与干细胞杂志(电子版)》[ISSN:2095-1221/CN:11-9310/R] 期数: 2016年第6卷第3期 栏目: 论著

作者:焦国华 高洪丽 吴贽 等

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页码:160-166

摘要:

  【摘要】 目的 探讨差速贴壁法对小型猪脂肪间质干细胞(ADSC)提取和纯化的可行性。方法 从两成软骨10月龄的中国实验用I系小型猪皮下脂肪组织获取ADSC,培养4 ~ 6 h倒置显微镜下观察,见少量细胞贴壁,立刻将含有未贴壁细胞的培养基接种到新培养瓶内继续培养,传统培养法不换培养瓶,以后均每3 d换液1次。完全培养基传至第3代MTT法绘制生长曲线,并测定两种培养法获得的细胞不同代数的贴壁时间;诱导培养基向脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞诱导并鉴定。贴壁时间、表面抗原阳性率、分化诱导染色阳性率实验数据比较采用单因素方差分析及t检验。结果 采用差速贴壁培养法可分离培养出小型猪ADSC,并可除去部分贴壁的成纤维细胞、上皮细胞和脂滴,传代后培养瓶中脂滴明显减少;差速贴壁培养法获得的ADSC在贴壁时间方面较传统方法获得的ADSC短,前者传代后的贴壁时间(3.5±0.2)h较后者(5.8±0.3)h短,差异具有统计学意义(t = 12.55,P = 0.01);两种方法获得的ADSC中CD34阳性率:差速法为(1.17±0.01)﹪,传统法为(0.99±0.03)﹪;CD44阳性率:差速法为(88.90±0.03)﹪,传统法为(89.23±0.10)﹪;CD106阳性率:差速法为(1.18±0.05)﹪,传统法为(1.56±0.06)﹪;差异均统计学意义(t = 0.12,1.23,0.37,P = 0.06,0.07,0.06)。油红O、苏丹黑B、Von kossa、茜素红、阿尔新蓝、II型胶原染色结果表明差速贴壁法获得的ADSC可分化为脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞,且阳性染色率分别为(78±2)﹪、(82±6)﹪、(85±1)﹪、(83±3)﹪、(76±9)﹪、(74±1)﹪,较传统法的(68±1)﹪、(69±2)﹪、(73±0)﹪、(75±1)﹪、(69±3)﹪、(65±4)﹪高,差异具有统计学意义(t = 5.21,12.56,16.27,10.33,17.01,23.97;P = 0.02,0.03,0.01,0.01,0.00,0.00)。结论 采用差速贴壁培养法可从小型猪皮下脂肪组织可以分离培养出ADSC,从细胞形态学、生物学特性及多向分化能力等方面都较传统法获得的ADSC具有优势。
  【关键词】 脂肪细胞; 间质干细胞; 成骨细胞; 软骨细胞; 细胞培养技术