miR-30a-5p对CD133+ Huh7人肝癌干细胞侵袭和迁移能力的影响

《中华细胞与干细胞杂志(电子版)》[ISSN:2095-1221/CN:11-9310/R] 期数: 2016年第6卷第3期 栏目: 论著

作者:刁竞芳 莫嘉强 赵祥 等

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页码:167-173

摘要:

  【摘要】 目的 本研究采用磁珠法对肝癌干细胞进行分选,进而使用miR-30a-5p模拟物和抑制物进行基因治疗,观察其对肝癌干细胞侵袭和迁移能力的影响,并探讨其可能的分子生物学机制。方法 采用免疫磁珠分选法分选CD133+ Huh7肝癌干细胞,流式细胞术检测分选后CD133+细胞比例,分别采用miR-30a-5p模拟物或抑制物转染肝癌干细胞设为模拟物转染组(30aM组)和抑制物转染组(30aI组),并设立空白对照组(NC组)。采用RT-PCR法检测细胞miR-30a表达水平,Transwell法测细胞侵袭和迁移能力,western blot法检测功能蛋白表达量,荧光素酶报告基因实验测定Wnt/β-catenin信号通路荧光素酶活性,每组实验重复3次。肝癌干细胞分选效率、miR-30a-5p表达水平实验数据的比较采用单因素方差分析和t检验。结果 磁珠分选后的Huh7细胞中CD133阳性率为(84.6±0.56)﹪,明显高于未进行分选的Huh7肝癌细胞的CD133阳性率(1.38±0.12)﹪,差异具有统计学意义(t = -16.41,P = 0.01)。30aM组CD133+Huh7肝癌干细胞中的相对表达水平(6.23±0.12)较NC组的(1.00±0.04)明显上调;miR-30a-5p抑制物转染组(30aI组)的相对表达水平(0.07±0.01)较NC组明显下调,差异均具有统计学意义(t =15.98,-7.76,P = 0.00,0.00)。Transwell侵袭实验显示,NC组、30aM组和30aI组的CD133+ Huh7肝癌干细胞的穿膜细胞数量分别为(28.33±2.10)个/孔、(12.52±1.03)个/孔和(72.09±7.11)个/孔,差异具有统计学意义(t = 15.00,-23.01,P = 0.01,0.00)。Transwell迁移实验结果显示,NC组、30aM组和30aI组的CD133+Huh7肝癌干细胞的穿膜细胞数量分别为(21.76±1.21)个/孔、(8.74±1.96)个/孔和(145.51±11.23)个/孔,差异具有统计学意义(t = 8.09,-33.10,P = 0.02,0.00)。Western blot实验结果显示,30aM组的兔抗人波形蛋白(Vimentin)、wnt1、基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP3蛋白的表达量较NC组低,上皮-钙粘素(E-cadherin)蛋白的表达量较NC组高,神经-钙粘素(N-cadherin)、锌指转录因子(Snail)、MMP9蛋白的表达量没有明显差异;30aI组的Vimentin、wnt1、MMP2、MMP3蛋白的表达量较NC组高,E-cadherin蛋白的表达量较NC组低,N-cadherin、Snail、MMP9蛋白的表达量没有明显差异。荧光素酶报告基因实验结果显示,30aM组Wnt/β-catenin信号通路的转录活性(3.23±0.51)明显低于NC组的(16.45±1.22)(t = -16.33,P = 0.01)。30aI组Wnt/β-catenin信号通路的转录活性(27.16±0.96)与NC组相比,差异具有统计学意义(t = 20.94,P = 0.00)。30aM组Vimentin的转录活性(4.98±0.33)明显低于NC组的(7.80±0.64)(t = -13.01,P = 0.02)。30aI组Vimentin的转录活性(9.31±1.50)与NC组相比,差异具有统计学意义(t =12.39,P = 0.02)。结论 miR-30a-5p对CD133+Huh7肝癌干细胞的侵袭和迁移具有明显的抑制效果,有望通过对肝癌干细胞的治疗提高肝癌基因治疗的效果。
  【关键词】 肿瘤干细胞; 微RNAs; 细胞运动; 肿瘤侵润
 
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